Ekstrakcja RNA z ludzkiego koronawirusa za pomocą zestawu OMNI Universal RNA Purification Kit i Bead Ruptor Elite

Ekstrakcja wirusowego RNA z próbek tkanek jest kluczową metodą stosowaną do potwierdzania obecności podejrzenia infekcji wirusowej.

Wraz ze wzrostem liczby infekcji wirusowych na całym świecie, naukowcy i klinicyści ze wszystkich sektorów skupili się na intensyfikacji badań nad schorzeniami wywoływanymi przez wirusy. W przedstawianej procedurze wykazaliśmy, że zestaw OMNI Universal RNA może być stosowany do ekstrakcji wirusowego RNA z ludzkiego koronawirusa 229e (HCoV-229e) w supernatancie z butelek do hodowli tkankowych zakażonych ludzkich fibroblastów płuc.

Dodatkowo próbki te zostały przetworzone przy użyciu Bead Ruptor Elite, skracając o połowę czas potrzebny na początkowe etapy homogenizacji z użyciem zestawu RNA do ekstrakcji. Ten półautomatyczny etap przygotowania próbki zwiększył przepustowość tradycyjnych protokołów ekstrakcji RNA z kolumny wirówkowej, umożliwiając przetwarzanie do 24 próbek w ciągu 30 sekund, podczas gdy tradycyjne metody wymagają do 24 minut dla tej samej procedury.

Zastosowanie Bead Ruptor Elite do obróbki przy użyciu zestawu RNA skutkowało zwiększoną wydajnością produktu wirusowego RNA, wykrywaną za pomocą RT-qPCR, co sugeruje, że próbki o niskim stężeniu mogą być wykrywalne. Poprzez amplifikację genu nukleokapsydu HCoV-229e z supernatantu hodowli tkankowej wykazaliśmy zwiększoną wydajność i skuteczność homogenizacji w homogenizatorze kulkowym w porównaniu z ekstrakcją wirusowego RNA przy użyciu tradycyjnych zestawów.

Metody – hodowla komórkowa i wzrost wirusa

Dodano ludzki koronawirus 229e (HCoV-229e, w obecności MOI 1,4 do 60% płynnych komórek MRC-5 (fibroblastów płuc),  48 godzin po wysianiu. Kolbę wypełniono pożywką DMEM nasyconą 5%, inaktywowaną termicznie FBS i 1% L-glutaminą, inkubowano w 37°C z 5% CO2. Supernatant hodowli komórkowej zebrano 72 godziny po zakażeniu, gdy zaobserwowano 70% CPE.

Ekstrakcja wirusowego RNA z supernatantu

300 µl supernatantu dodano do 300 µl buforu RLB (z zestawu Omni Universal RNA Purification Kit, nr kat. 26-010V) w pustej 2 ml probówce do homogenizacji (nr kat. 19-649) lub wstępnie napełnionej probówce Universal Microbial Homogenizing Mix (nr kat. 19-632).
Następnie probówki z próbkami homogenizowano jedną z dwóch metod: 1, stosując Bead Ruptor Elite, 1 x 30s cykl przy 4,2 m/s; lub 2, vorteksowanie przez 60s przy użyciu miksera wirowego podobnego do miksera Vortex 24 (PN 28-101).
Po zakończeniu początkowego etapu homogenizacji, pozostałą część ekstrakcji przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta zestawu OMNI Universal RNA Purification Kit z jednym wyjątkiem: 100% EtOH został zastąpiony 70% EtOH wymaganym w kroku 7 protokołu zestawu.
RNA eluowano z kolumny do oczyszczania kwasów nukleinowych przy użyciu wody DPEC, umożliwiając reakcję na kolumnie 5 minut przed wirowaniem.

Wyniki

Produkt reakcji RT-qPCR przeniesiono do kolb z hodowlą komórek MRC-5. Eksperyment zakończono po 72 godzinach po infekcji oraz po obserwacji 70% degradacji komórki (CPE). Skuteczność 4 metod homogenizacji próbek oceniano przy użyciu wartości Cq i potwierdzano na 2% żelu agarozowym.

Dane wskazują na udaną ekstrakcję wirusowego RNA z supernatantu hodowli komórkowej przy użyciu zestawu OMNI Universal RNA Purification Kit.
Homogenizacja przy użyciu Bead Ruptor Elite zwiększyła wydajność wyekstrahowanego RNA w porównaniu z tradycyjnym vorteksem, o czym świadczą niższe wartości Cq
w próbkach poddanych obróbce przy użyciu homogenizatora kulkowego w porównaniu z vorteksowaniem.

Zwiększona intensywność prążków podczas wizualizacji amplikonu jest widoczna w homogenizacji przy użyciu Bead Ruptor Elite, zarówno z, jak i bez pożywki z kulkami ceramicznymi 0,1 mm, w porównaniu z prążkami dla próbek homogenizowanych przy użyciu vortexu, zarówno z pożywką z kulkami ceramicznymi 0,1 mm, jak i bez niej.

Wyniki potwierdzono na 2% żelu agarozowym z ilościowymi wartościami Cq. W powtórzeniach kontroli negatywnej, amplifikacji genu N na niezainfekowanym supernatancie hodowli MRC-5, wzrost krzywej po 30 cyklu reakcji przypisano łączeniu się pozostałych jeszcze w mieszaninie reakcyjnej starterów.

Podsumowanie

Zestaw OMNI Universal RNA Purification Kit z powodzeniem wyekstrahował wirusowy RNA z supernatantu hodowli tkankowej ze wszystkich próbek przy użyciu wszystkich czterech ocenianych procedur.

Warto zauważyć, że porównując dwie metody homogenizacji dla tej ekstrakcji, homogenizacja przy użyciu Bead Ruptor Elite wyekstrahowała więcej RNA niż vorteks, jak pokazano na wizualizacji żelowej amplikonów genu nukleokapsydu HCoV-229e.

Oprócz zwiększenia całkowitej wydajności wyekstrahowanego RNA należy zauważyć, że Bead Ruptor Elite zwiększył również przepustowość ekstrakcji i skrócił czas wymagany do ich przeprowadzenia. Urządzenie może przetwarzać 24 próbki w jednym cyklu, więcej niż w przypadku tradycyjnego vorteksowania, jednocześnie skracając czas etapu homogenizacji o połowę z 60 sekund na próbkę (i do 24 minut na partię 24 próbek) do zaledwie 30 sekund.

Jasny niebieski: Użycie homogenizatora kulkowego Bead Ruptor Elite z probówkami 2 mL bez podłoża  (PN 19-649)

Pomarańczowy: Użycie vortexu z probówkami 2mL bez podłoża (PN 19-649)

Ciemny niebieski: Użycie homogenizatora Bead Ruptor Elite z probówkami 2mL z podłożem ( PN 19-632)

Żółty: Użycie vortexu z probówkami 2mL z podłożem (PN 19-632)

Zielony: Kontrola negatywna

Zdjęcie 1: Ekspresja amplikonu genu N po reakcji RT-qPCR na 2% żelu agarozowym

Kanał 1: Drabinka DNA 100bp (firmy BioRad)

Kanały 2, 3, 4: Ekstrakcja przy użyciu vortexu, w 2mL probówkach bez podłoża

Kanały 5, 6, 7:  Ekstrakcja przy użyciu vortex, w 2mL probówkach z podłożem Universal Microbial Homogenizing Mix

Kanały 8, 9, 10: Ekstrakcja z użyciem Bead Ruptor Elite w  2mL probówkach

Kanały 11, 12, 13: Ekstrakcja z użyciem Bead Ruptor Elite w 2mL probówkach z podłożem Universal bez podłoża Microbial Homogenizing Mix

Kanał 14: Pusty

Kanał 15: Niezainfekowane komórki MRC-5, RNA ekstrahowane przy użyciu Bead Ruptor Elite w 2mL probówkach z podłożem Universal Microbial Homogenizing Mix

Źródło: APPLICATION NOTE 202004 OMNI International, Inc.