Jak zminimalizować ryzyko kontaminacji podczas prowadzonego eksperymentu?

Rozwój nowoczesnych metod laboratoryjnych, zwłaszcza opartych o amplifikację cząsteczek DNA w próbkach, odgrywa istotną rolę we współczesnej diagnostyce.
Technika łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), polega na powielaniu in vitro nawet najmniejszej ilości kopii materiału genetycznego, z wykorzystaniem specjalnych starterów i enzymów. Ilościowa łańcuchowa reakcja polimerazy (qPCR), zwana również metodą PCR w czasie rzeczywistym (Real-time PCR), jest wariantem klasycznej reakcji PCR, umożliwiając analizę przyrostu produktu w czasie rzeczywistym. 
Zanieczyszczenia, nawet śladowymi ilościami DNA, stanowią bardzo poważny problem podczas pracy z czułymi technikami, takimi jak PCR/qPCR i często mogą prowadzić do otrzymywania wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich.

Kontaminacje zdarzają się nawet w doświadczonych laboratoriach i często pozostają niezauważone. Niestety, znalezienie samego źródła zanieczyszczenia jest często bardzo trudne. Wymaga czasu i wykonania niezbędnych powtórzeń.

Jak więc uniknąć kontaminacji w laboratorium?
W tym artykule wyjaśniono, skąd biorą się zanieczyszczenia i jak je można zidentyfikować. Przedstawimy również główne metody pozwalające na ich zminimalizowanie.

Zanieczyszczenia w badaniach qPCR

Skąd się biorą zanieczyszczenia?

Przyczyny powstawania kontaminacji w eksperymentach qPCR, można zasadniczo podzielić na dwie główne kategorie: środowiskowe i chemiczne.

Mianem zanieczyszczeń środowiskowych określa się każde zanieczyszczenie, powstałe podczas przeprowadzania testu.

Instrumenty i urządzenia, wykorzystywane w trakcie pracy m.in. pipety, końcówki, roboty czy homogenizatory, mogą narażać próbki na zanieczyszczenie.

Jednak w przypadku badań opartych na technice qPCR, kontaminacja na etapie przygotowania materiału,  stanowi dodatkowe i znaczące zagrożenie. Jednym z głównych źródeł jest nieumiejętne otwieranie probówek, przyczyniające się do tworzenia aerozoli, co oznacza, że ​​część próbki może przedostać się do środowiska i szybko ulec amplifikacji, powodując m.in. kontaminacje krzyżowe między próbkami.

Zanieczyszczenie chemiczne może mieć źródło w dowolnym odczynniku, używanym w laboratorium. Składniki, takie jak bufory, roztwory czy nukleotydy, mogą potencjalnie spowodować zanieczyszczenie eksperymentu qPCR. Dlatego należy używać wyłącznie chemikaliów najwyższej jakości i czystości.

Jak rozpoznać czy doszło do kontaminacji?

Zapewnienie odpowiednich kontroli w trakcie eksperymentu, jest kluczem do wczesnego wykrycia kontaminacji, a tym samym do zminimalizowania ich negatywnych efektów. Odpowiednie kontrole umożliwiają również rozwiązywanie problemów, optymalizację warunków oraz walidację eksperymentu i późniejszych wyników. Ale jakich rodzajów kontroli należy użyć, aby zapewnić wiarygodne wyniki badań?

Kontrola negatywna NTC (ang. No Template Controls)

Kontrola NTC (ang. no template control) powinna być stosowana w każdym przebiegu reakcji real-time PCR. NTC jest próbką o składzie mieszaniny reakcyjnej identycznym z próbką badaną, za wyjątkiem matrycy, która zastąpiona jest wodą. Jeśli uzyskuje się w niej wzrost fluorescencji, świadczy ona o kontaminacji pochodzącej albo ze składników reakcji bądź środowiska. W przypadku braku zanieczyszczenia nie oczekuje się amplifikacji podczas cykli termicznych.

Negatywna kontrola ekstrakcji NCE (ang. Negative Control of Extraction)

Podobnie jak NTC, NCE są również kontrolą negatywną, ale prowadzoną dla procesu ekstrakcji. Umożliwiają identyfikację zanieczyszczenia, które wystąpiło na wcześniejszym etapie procesu – podczas izolacji materiału genetycznego.

Negatywna kontrola amplifikacji NAC (ang. No Amplification Controls)

W tej negatywnej kontroli, polimeraza DNA jest pomijana w trakcie nastawiana reakcji PCR, aby wykluczyć fałszywie pozytywny wynik, wynikający z kontaminacji podczas przygotowywania mixu do PCR.

Kontrole pozytywne PC (ang. Positive Controls)

Powszechne są dwa rodzaje kontroli pozytywnych: egzogenne i endogenne. Zadaniem kontroli egzogennych jest weryfikacja poprawności procesu izolacji DNA i reakcji PCR. Użycie egzogennej kontroli wewnętrznej pozwala dodatkowo na ocenę jakości próbki i możliwej inhibicji reakcji PCR. Najczęściej stanowi egzogenny fragment kwasu nukleinowego oraz układ starterów i sondy do jej namnożenia i detekcji, który jest dodawany do próbek. W przypadku braku amplifikacji, oznacza to, że reakcja PCR nie jest ustawiona prawidłowo lub próbka zawiera inhibitor.

Kontrole endogenne, są używane do normalizacji próbek, a także do upewnienia się, że reakcja zachodzi. W przypadku tych kontroli powszechnie stosuje się geny referencyjne.

Jak uniknąć kontaminacji podczas badań?

Przede wszystkim należy pamiętać, że gdy tylko wykryje się kontaminację, nie ma sposobu na jej usunięcie z trwającego eksperymentu. Dlatego tak ważne jest, aby w pierwszej kolejności zapobiegać zanieczyszczeniu próbki.
Można rozważyć wiele podejść, takich jak wydzielenie osobnych przestrzeni, czyste przetwarzanie próbek i wprowadzenie automatyzacji. Poniżej omówimy każdy z nich bardziej szczegółowo.

Rozdziel swoje obszary pracy

Jednym z najskuteczniejszych sposobów zapobiegania zanieczyszczeniom, jest wydzielenie dedykowanych stref dla poszczególnych etapów. Korzyści z tego rozwiązania mogą być ograniczone, jeśli nie ma wystarczającej przestrzeni laboratoryjnej, ale jako minimum, należy utworzyć oddzielne obszary przed i po amplifikacji.

Jeśli pozwala na to miejsce, można dodatkowo wydzielić trzeci obszar, służący do przygotowywania rozcieńczeń i mieszanin reakcyjnych. W idealnej sytuacji również systemy wentylacyjne między strefami nie powinny być połączone.

Poszczególne obszary powinny mieć swój własny, oddzielny sprzęt: pipety, końcówki do pipet i środki ochrony indywidualnej. Aby uniknąć kontaminacji między etapami reakcji, personel powinien w miarę możliwości pracować liniowo.

Co najważniejsze, po zakończeniu pracy w obszarze po amplifikacji nie należy wchodzić do obszaru przedamplifikacyjnego.

Pamiętaj, aby często odkażać powierzchnie robocze i sprzęt dedykowanymi środkami. Pamiętaj, ty również możesz być źródłem zakażenia (nawet przedmioty takie jak biżuteria mogą stwarzać ryzyko kontaminacji).

Używaj odpowiednich sprzętów

Po wydzieleniu przestrzeni, nadszedł czas na wybór sprzętu. Pamiętaj, aby starannie wybrać zarówno pipety, jak i końcówki do pipet, ponieważ mogą one stanowić również źródło zanieczyszczeń.

Wybierając pipetę, ważne jest, aby można ją było sterylizować w autoklawie, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
Należy pamiętać, że nie wszystkie części pipety można sterylizować w autoklawie, dlatego należy zapoznać się z instrukcjami producenta, aby określić najbardziej odpowiedni protokół.

Jeśli używasz pipet z wyporem powietrza, końcówki z filtrem zapewniają skuteczną ochronę przed aerozolem, dzięki czemu pipeta i próbka są wolne od zanieczyszczeń. Upewnij się, że filtry i końcówki pipet są wykonane z trwałych materiałów wysokiej jakości, takich jak polipropylen. Ponadto szukaj tych, które zostały wyprodukowane w sterylnym, czystym środowisku, aby upewnić się, że są wolne od zanieczyszczeń.

W zależności od celu testu, w razie potrzeby można również użyć pipet wyporowych. Pipety te są kompatybilne z końcówkami z tłokiem kapilarnym (CP), a ponieważ pomiędzy tłokiem a odczynnikami nie ma powietrza, zmniejsza to ryzyko zanieczyszczenia.

Rozważ wdrożenie automatyzacji

Jeśli chcesz jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, rozważ wdrożenie automatyzacji. Ręczne pipetowanie i składanie reakcji PCR, zwłaszcza przy wielu powtórzeniach i próbkach, obarczone jest dodatkowym ryzykiem wprowadzenia błędów, m.in. dodanie niewłaściwej próbki do niewłaściwego dołka.

Możesz temu zaradzić, automatyzując proces, aby zminimalizować interwencję człowieka, a tym samym wyeliminować m.in. ryzyko przypadkowego zanieczyszczenia

Idealnym rozwiązaniem jest wybór odpowiedniej stacji pipetującej, która umożliwia np. przygotowanie rozcieńczeń i składanie reakcji. Dodatkowo można przeprowadzić normalizację stężeń zarówno RNA, jak i DNA, zgodnie z zaleceniami MIQE (ang. Minimal Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) .

Zmienne stężenia matrycy, prowadzą do różnic w wydajności reakcji odwrotnej transkrypcji i wartości Ct.
Automatyzacja eliminuje ryzyko błędu i zmienności między użytkownikami, a tym samym poprawia wiarygodność uzyskanych wyników.

Wpływ kontaminacji na przebieg eksperymentu podważa zaufanie do otrzymanych wyników. 
Wdrożenie odpowiednich systemów kontroli od początku badań może pomóc zidentyfikować zanieczyszczenie, zanim będzie za późno — oszczędzając czas i pieniądze.

Ponadto oddzielenie przestrzeni, użycie odpowiednich sprzętów i zastosowanie automatyzacji, może dać największe szanse na uniknięcie kontaminacji w eksperymentach qPCR i zachowanie integralności próbki.

Dzięki ponad 50-letniemu doświadczeniu GILSON® dysponuje wiedzą, doświadczeniem i sprzętem, aby wspierać społeczność naukową w utrzymaniu pełnego zaufania do integralności próbki.

Więcej informacji o omawianej aparaturze znajdziesz na stronie kategorii.