Oznaczanie laktozy w produktach mlecznych bez laktozy metodą wysokosprawnej anionowymiennej chromatografii z pulsową detekcją amperometryczną
Laktoza jest głównym disacharydem występującym w produktach mlecznych i jest katabolizowana do glukozy i galaktozy przez enzym laktazę. U oób z nietolerancją laktozy występuje niedobór laktazy, dlatego laktoza nie jest całkowicie katabolizowana. Choć nietolerancja laktozy nie jest stanem chorobowym stwarzającym niebezpieczeństwo, jej powszechność na całym świecie przyczyniła się do powstania dużego rynku produktów bez laktozy. Dostępne w sprzedaży produkty bez laktozy powstają w wyniku rozkładu laktozy na glukozę i galaktozę metodą hydrolizy enzymatycznej. Jednakże powstałe w ten sposób produkty mleczne zawierają różną ilość resztkowej laktozy. Stworzyło to potrzebę opracowania prostych, niezawodnych i dokładnych metod analitycznych pozwalających na ilościowe oznaczanie laktozy. Poddanie mleka obróbce cieplnej powoduje zmianę jego struktury i składu chemicznego, przy czym zakres tych zmian zależy od temperatury i czasu podgrzewania. Laktuloza to disacharyd zawierający galaktozę i fruktozę, który nie występuje naturalnie w surowym mleku, ale powstaje w procesie obróbki cieplnej mleka w wyniku izomeryzacji laktozy. Zawartość laktulozy w mleku można wykorzystać do określenia metody sterylizacji mleka. Średnie stężenie laktulozy przy sterylizacji w pojemnikach wynosi 744 mg/l, podczas gdy w mleku poddanym obróbce metodą pasteryzacji w niskiej temperaturze wynosi ono tylko 3,5 mg/l. 1 Obecnie dostępne metody analityczne służące do wykrywania laktozy obejmują detekcję w średniej podczerwieni, fluorometrię, metody fotometryczne, polarymetrię, detekcję grawimetryczną, metody różnicowego pH i oznaczenia enzymatyczne. 2–5 Metody te są czasochłonne ze względu na szeroki zakres przygotowania próbek. Ponadto nie ma możliwości odróżnienia poszczególnych węglowodanów, a pomiary polarymetryczne zakłócają pomiary innych optycznie czynnych składników. Metoda 984.15 stowarzyszenia AOAC (Association of Official Analytical Chemists) opiera się na enzymatycznej hydrolizie laktozy do glukozy i galaktozy przy pH wynoszącym 6,6 przez β-galaktozydazę. Metoda ta jest jednak czasochłonna i wymaga szerokiego zakresu przygotowań odczynników. Podane granice oznaczalności tej analizy mogą nie pozwalać na oznaczenie laktozy w próbkach niezawierających laktozy. 6 W pracy opisano czułą i dokładną metodę oznaczania laktozy i laktulozy w produktach mlecznych, w tym w produktach bez laktozy, z wykorzystaniem wysokosprawnej anionowymiennej chromatografii połączonej z pulsową detekcją amperometryczną (HPAE-PAD) w sześciu różnych produktach handlowych. HPAE-PAD to szeroko stosowana technika oznaczania monosacharydów, disacharydów, oligosacharydów, mniejszych polisacharydów, kwasów sialowych i innych kwasów cukrowych. Jako metoda detekcji bezpośredniej HPAEPAD eliminuje błędy związane z derywatyzacją analitu. Kolumna Thermo Scientific™ Dionex™ CarboPac™ PA20 w połączeniu z technologią PAD umożliwia wysokorozdzielcze rozdzielanie małych i większych węglowodanów z czułą detekcją. Opisaną tutaj metodę zastosowano do oznaczenia niskich stężeń laktozy w kilku produktach dostępnych w sprzedaży — cztery z nich były produktami bez laktozy. W serach Gouda i Havarti bez laktozy nie wykryto laktozy, natomiast w serze twarogowym bez laktozy i mleku bez laktozy oznaczono odpowiednio 2,17 mg/ml i 0,6 mg/ml laktozy